重组人源超氧化物歧化酶研究进展（二） 且不会引起免疫反应

二、重组展通过基因突变改善

SOD的人源性能hCu/Zn-SOD作为抗氧化酶能够减轻活性氧自由基对细胞的损伤，且不会引起免疫反应，超氧但是化物hCu/Zn-SOD的大规模生产和临床使用受到产量和可溶性的限制。通过定点突变改变hCu/Zn-SOD的歧化一些氨基酸残基可以改善其产量和品质。

hCu/Zn-SOD包含2个亚基，酶研每个亚基又包含4个半胱氨酸（Cys）残基，究进其对应的重组展位置分别是6、57、人源111和146，超氧其中Cys57和Cys146之间形成分子内二硫键，化物6位和111位是歧化游离的半胱氨酸残基。周赞虎等应用PCR定点突变技术把hCu/Zn-SOD基因的酶研Cys111密码子突变为Ala111密码子，通过随机同源重组将突变后的究进hCu/Zn-SOD整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942中并实现表达，表达产物在80℃保温30min后仍具有95%的重组展活力，耐热能力比天然hCu/Zn-SOD有了较大的提高。张琨等通过重叠PCR技术将天然hCu/Zn-SOD基因的Cys6密码子突变为Ala6密码子，Cys111密码子突变为Ser111密码子，通过大肠杆菌重组表达得到改构体蛋白rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，从1g湿菌体中获得的活性蛋白总量高于未改构体的2倍，改构体的热稳定性也获得大幅度提高。高淑彬分别构建天然hCu/Zn-SOD和Cys111突变成Ala111的突变hCu/Zn-SOD表达载体，并在大肠杆菌中表达，其表达量都占菌体总蛋白的45%以上，突变hCu/Zn-SOD酶活力和稳定性均高于天然hCu/Zn-SOD，证明通过基因突变可以改善酶的性能。通过随机整合方式将突变的hCu/Zn-SOD基因整合到蓝藻Synechoccussp.PCC7942染色体上，动物实验证明转突变hCu/Zn-SOD基因的蓝藻口服后具有较强的抗氧化作用，为进一步研究开发半衰期长的可直接口服的hCu/Zn-SOD奠定了基础。Zhang等将hCu/Zn-SOD的6位和111位的半胱氨酸（C）突变为丝氨酸（S），构建了3个突变体mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S和mhSOD1/C6S/C111S。结果表明，与野生型相比，除了C6S突变使重组蛋白可溶性表达降低以外，C111S和C6S/C111S突变均能增加重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，进而提高重组蛋白的产量，且C111S突变效果优于C6S/C111S。此外，mhSOD1/C111S显示了更低的毒性和更强的美白和抗辐射活性。因此，C111S突变是工业化大规模生产和开发重组人源SOD的一个有效策略。

三、通过融合蛋白技术改善

SOD的性能融合蛋白技术是指利用基因工程技术，将两段或多段编码功能蛋白的基因有目的地连接在一起并进行表达，从而产生一种新的人工融合蛋白的方法。由相对较小的结构域拼装成较大的多功能蛋白是自然进化的一个重要因素。因此，在基因水平上将不同的结构域进行连接，并且使其表达成融合蛋白，是形成多功能蛋白、降低原蛋白毒副作用及改造天然蛋白的重要方法。由于有新功能蛋白加入，融合蛋白的性能被优化，并产生新的生物功能和活性，所以这种新型的人工蛋白具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

1、PTD-SOD融合蛋白

细胞膜上没有专一的SOD通道或受体，外源SOD难以进入细胞内发挥抗氧化作用，因而限制了其临床应用。HIV-1反式激活蛋白TAT的蛋白转导结构域是一种广谱的能携带大分子物质穿透动物细胞膜的小分子多肽，可以解决SOD蛋白透膜相关难题。PTD可以引导多种多肽和蛋白进入目标细胞，具有转导速度快、效率高和温度适应性广等优点，且能够透过血脑屏障。大部分PTD或与PTD共价结合的蛋白在跨过细胞膜后转运到细胞核而不是细胞质或其他细胞器，因此PTD运输系统只适用于在细胞核内发挥功能的药物分子的转运。王宇等研究PTD4介导的Cu/Zn-SOD对大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤（HRI）的影响，发现重组的PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白可以明显减少HRI导致的细胞凋亡，从而减轻大鼠心肌细胞的HRI，证明了重组PTD4-Cu/Zn-SOD可以高效穿透心肌细胞，改善心肌细胞缺血再灌注损伤。Yao等在骨癌研究中发现，活性氧在一定程度上参与了肿瘤疼痛的发展和持续，而重组PTD-Cu/Zn-SOD可以减弱这种作用，因此其在骨癌治疗中可作为一种潜在的辅助治疗剂。Zhang等将所获得的Mn-SOD、PTD-Mn-SOD和脂质体Mn-SOD用于保护人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤，结果发现，与天然Mn-SOD相比，PTD-Mn-SOD和脂质体Mn-SOD可发挥更强的药理作用。孟丽华和薛荣亮通过检测PTD4-Cu/Zn-SOD进入人星形胶质细胞内的荧光蛋白的分布情况，发现PTD4-Cu/Zn-SOD融合蛋白能够穿过细胞膜，且可以降低因细胞缺氧损伤所致的细胞凋亡。PTD与SOD进行融合的方法简单易行，可提供大量廉价、安全、高活性的重组SOD制品。需要强调的是，尽管PTD-Cu/Zn-SOD融合蛋白具有良好的穿透细胞膜特性，但没有组织特异性，若是静脉给药可能会迅速导入血管内皮细胞或血细胞，不能很好地到达靶区发挥作用，因此需要进一步改进结构或给药途径以解决其靶向问题。

2、PEP-SOD融合蛋白

PEP-1是一种人工设计的主要用于转导大分子蛋白的细胞穿透肽，它能高效率地携带具有治疗效果的蛋白进入细胞并发挥其生物学效应。Liu等构建了表达PEP-1-hMnSOD融合蛋白的表达载体，并在双歧杆菌中成功表达了PEP-1-hMnSOD融合蛋白。在进一步临床研究中，将透膜性和稳定性较差的hMnSOD通过PEP-1递送到结肠炎症细胞内，通过对炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平以及结肠组织学损伤检测，发现PEP-1-hMnSOD融合蛋白能够有效地减轻葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎。因此口服表达PEP-1-hMnSOD融合蛋白的双歧杆菌工程菌可作为治疗溃疡性结肠炎的新方法。

神经干细胞移植已被证明是一种潜在的治疗创伤性脑损伤的策略。Jia等探索NSCs移植配合PEP-1-SOD1共同治疗大鼠脑缺血的可能性。体外实验证明，PEP-1-SOD1能提高神经干细胞的增殖和分化；体内实验表明，与单独NSCs移植相比，PEP-1-SOD1联合NSCs移植策略对大鼠TBI后的功能恢复有明显的促进作用。Yoo等探讨了Cu/Zn-SOD对脂肪组织来源间充质干细胞抗脊髓缺血损伤的促进作用。结果显示PEP-1-SOD1和Ad-MSCs联合应用进一步增强了Ad-MSCs对神经元缺血损伤的保护作用。相对于PTD融合蛋白，PEP融合蛋白具有其独特优势。PTD融合蛋白进入细胞后，所携带的功能蛋白需要在细胞内分子伴侣HSP90的帮助下重折叠才能发挥其生物学效应，靶蛋白的生物活性依赖于细胞内HSP90的重折叠效率，因此PTD融合蛋白技术的临床应用受到了一定限制。而PEP融合蛋白能够直接携带具有生物活性的功能蛋白进入细胞发挥生物学效应，同时它还具有转导效率高、无毒性及不受血清影响等优势，这使细胞穿透肽PEP在应用上更具有潜力，可能成为更适合于蛋白治疗的载体工具。

3、多功能融合蛋白

研究者们曾尝试将不同功能的蛋白与SOD进行组合，将不同蛋白的优势和特点融合在一起，以赋予目的蛋白多种新的属性和功能。周宇飞等为了增强胸腺素α1（Thyα1）的稳定性和免疫功能，采用胸腺素α1与人源SOD融合的策略，构建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1两个融合基因，并在毕赤酵母中实现了高水平表达。重组表达的融合蛋白经过进一步纯化后进行了活性检测，结果表明这两个融合蛋白既有SOD的活性，又有Thyα1的活性。盛明明等采用基因工程技术通过大肠杆菌制备一种兼具人源SOD和过氧化氢酶（CAT）活性的多功能融合蛋白CAT-PTD-SOD，该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在。在0.033mol/L、甚至0.067mol/L的H2O2溶液中，SOD活性在20min内无明显下降，证明其具备抗氧化和分解过氧化氢的双重作用。潘剑茹等构建了SOD1和穿膜肽R9的融合蛋白表达质粒GST（谷胱甘肽巯基转移酶）-SOD1-R9，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达出具有双效抗氧化功能的GST-SOD1-R9融合蛋白。该融合蛋白不仅能够清除多余的活性氧自由基，而且还能够修复或清除体内已被氧化损伤的生物分子，并再生氧化损伤的含巯基蛋白。Pan等研究了GST-TAT-SOD对顺铂损伤细胞的保护作用，证明GST-TAT-SOD通过直接清除多余的细胞内自由基和增强细胞抗氧化防御，可以解除顺铂治疗引起的生长抑制和细胞凋亡，因此GST-TAT-SOD可以作为顺铂诱导的细胞损伤的保护剂。此外，Pan等还通过小鼠全身X射线辐射实验，表明双功能GST-TAT-SOD对X射线辐射所致损伤有一定的防护作用，能够有效提高小鼠脾脏和肝脏的抗氧化能力、脾脏白髓数目和胸腺指数等，不仅显著提高了X射线辐照小鼠体重增长率，而且提高了接受致死量照射小鼠的存活率。GST-TAT-SOD的整体效果比阿米福汀好一些，所以GST-TAT-SOD可作为一种安全的辐射防护剂。

Luangwattananun等设计并研制了三功能融合蛋白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），与其之前设计的6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）相比，分子大小减小42%，其SOD和CAT活性分别提高22%和99%。在70℃孵育10min后，CS/S-TAT保留了54%的残余SOD活性，而M-TAT/CM的SOD活性完全消除。此外，在70℃时，CS/S-TAT的半衰期比M-TAT/CM提高了5倍。该酶能够跨膜进入哺乳动物细胞，可作为氧化损伤细胞的保护剂或治疗剂。因此，这项工作为设计和合成一种更稳定的多功能抗氧化酶提供了参考。总之，多功能的融合蛋白在抗氧化方面，往往比单一的抗氧化蛋白具有更大的优势。因此，融合蛋白的巨大优势使其有望成为新一代抗氧化药物的有力竞争者，为开发高效率抗氧化蛋白开辟了新途径。

四、总结与展望

SOD是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，具有重要的生物学功能。许多疾病（如肌萎缩侧索硬化、动脉硬化闭塞症、肿瘤转移和感染性疾病等）的产生和发展与SOD缺乏或不正确折叠有关。随着SOD研究不断深入和工业化生产规模逐渐扩大，SOD还被应用于化学、生物学、食品科学和植物病害预防等多个领域。但是受天然SOD的理化性质所限，如静脉注射后体内半衰期仅为6min，口服后在胃肠道中容易被破坏而失去疗效，膜透过率低等，这些因素使其在应用方面受到了很大的限制。目前，人们对SOD蛋白进行了化学修饰、人工有机合成SOD模拟物和运用基因工程法制备SOD等方面的探索，普遍认为通过基因工程制备重组人源SOD是最为经济、快捷、有效且安全的方法。随着现代生物技术的快速发展，国内外在微生物发酵生产重组SOD的菌种选育、高产菌开发和发酵工艺的优化等方面都取得了一定进展。通过基因工程技术生产重组人源SOD，既降低了其他来源SOD的免疫原性问题，又解决了人源SOD的来源问题，并且可以克服传统工艺限制，使人们可以按照自己的意愿定向改造目的蛋白。随着研究的进一步深入，基于基因工程主导的生物工程将逐渐推进重组SOD实现产业化，利用SOD开发的产品也将会得到更为广泛的应用。

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